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    5’-核苷酸酶活性检测试剂盒(可见分光光度法)

    发布时间: 2022-01-18  点击次数: 42次

    5’-核苷酸酶活性检测试剂盒(可见分光光度法)

    产品货号: BA1641

     

    产品规格: 50T

     

    产品简介

    5'-核苷酸酶(5'-NT)是一种对底物特异性不高的水解酶,可作用于多种核苷酸。广泛存在于各种植物、动物组织、 血清血浆中。5'-NT是一种特殊的磷酸酯水解酶,它只作用于核苷-5'-磷酸如AMP(腺苷-5'-磷酸或腺苷酸)生成无机 磷酸和核苷。通过定磷显色法测定所生成的无机磷含量,可以计算出5'-NT的活性高低。

    注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。

     

    产品组成:

    产品名称

    规格

    保存条件

    提取液

    液体30ml×1

    -20

    试剂一

    粉剂×2

    -20

    试剂二

    液体12ml×2

    4

    试剂三

    液体30ml×1

    4

    试剂四

    液体25ml×1

    4

    试剂五

    粉剂×1

    4

    试剂六

    粉剂×1

    4

    试剂七

    液体12ml×1

    室温

    标准品

    粉剂×1

    4

    溶液的配制: 

    1. 试剂五:临用前加入12 mL蒸馏水,充分溶解,用不完的试剂4℃保存两周。

    2. 试剂六:临用前加入12 mL蒸馏水,充分溶解,用不完的试剂4℃保存两周。

    3. 工作液配制:临用前取1支试剂一中加入到1瓶试剂二中充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存一周, 现用现配。

    4. 定磷试剂的配制:按H2O:试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。 若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。

    5. 标准品:8mg磷标准品。临用前加入4.6mL试剂四溶解配制成10μmol/mL的标准溶液,溶解后4℃保存两周。

     

    需自备的仪器和用品:

    天平、可见分光光度计、台式离心机、低温离心机、恒温水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移 液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

     

    操作步骤(仅供参考)

    一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献) 

    1. 组织:按照质量(g)﹕提取液体积(mL)15-10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液),冰上匀浆后于4℃,15000g离心10min,取上清置于冰上待测。

    2. 细胞:按照细胞数量(104个)﹕蒸馏水体积(mL)为500-10001的比例(建议500万个细胞加入1mL提取液), 冰浴超声波破碎细胞(功率300W,超声3s,间隔7s,总时间3min);然后4℃,15000g离心10 min,取上清置于冰上待测。

    3. 血清:直接检测。

    二、测定步骤

    1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。

    2. 将标准品用试剂四稀释至0.480.240.120.060.030.015μmol/mL标准液。

    3. 操作表(在1.5 mL EP管中操作

    1)酶促反应

    试剂名称(μl

    测定管

    对照管

    样本

    100

    100

    工作液

    400


    漩涡混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(植物及其他)反应30 min

    试剂三

    500

    500

    工作液

    -

    400

    2)显色反应

    试剂名称(μl

    测定管

    对照管

    标准管

    空白管

    上清液

    400

    400

    -

    -

    标准管

    -

    -

    400

    -

    试剂四

    -

    -

    -

    400

    定磷试剂

    800

    800

    800

    800

    漩涡混匀,40℃显色10min;取1mL反应液于1mL玻璃比色皿中,在660 nm下测定吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白,计算ΔA标准=A标准-A空白,ΔA测定=A测定-A对照(空白管只需测定1-2次)。

    三、5'-NT活性计算

    标准曲线的绘制: 以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y= kx+b,将ΔA带入方程得到x(μmol/mL)。

    5'-NT 活性的计算

    (1)按样本蛋白浓度计算

    酶活单位定义:每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

    5'-NT酶活(U/mg prot=x×V反总÷(V样×Cpr)÷T×103=333.3×x÷Cpr

    (2)按样本质量计算

    酶活单位定义:每克组织在反应体系中每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活单位。

    5'-NT酶活(U/g质量)=x×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×103=333.3×x÷W

    (3)按细胞数计算:

    酶活单位定义:每104个细胞在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

    5'-NT酶活(U/104 cell=x×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T×103=333.3×x÷细胞数量

    (4)按液体体积计算:

    酶活单位定义:每毫升液体在反应体系中每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

    5'-NT酶活(U/mL=x×V反总÷V样÷T×103=333.3×x

    V样:酶促反应中加入样本体积,0.1mLV反总:酶促反应总体积,1mLV样总:加入提取液的体积,1mLW:样本质量,gCpr:样本蛋白浓度,mg/mL;细胞数量:以万计;T:酶促反应时间,30 min103:单位换算,1μmol=103nmol

     

    注意事项:

    1. ΔA测定大于1或者A测定管大于1时,建议将样本用试剂四稀释后再进行测定。

     

    实验实例: 

    1. 0.1g小鼠肝,进行样本处理,取上清后按照测定步骤操作,测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.723- 0.534=0.189,带入标准曲线y=2.3928x+0.0165,计算x=0.0721,按照样本质量计算酶活得:

    5'-NT酶活(U/g质量)=333.3×x÷W=333.3×0.0721÷0.1=240.31 U/g 质量。

    2. 0.1g稗草,进行样本处理,取上清后按照测定步骤操作,测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.367-0.281=0.086, 带入标准曲线y=2.3928x+0.0165,计算x=0.0290,按照样本质量计算酶活得:

    5'-NT酶活(U/g质量)=333.3×x÷W=333.3×0.0290÷0.1=96.657 U/g质量。

     


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